幼幼嫩穴 Western blot 实际大忌——稀里朦拢跑内参卵白

熊叔鸡汤：一门实际期间，不要因为成效了几次就怡然自得，也不要因为失败而目空一生幼幼嫩穴，搞明晰旨趣，切忌稀里朦拢，细节决定成败......

早年间刷论坛时一则帖子回答引东说念主注释：不好好选内参的流泪史

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组会上问某一位同学，你为什么内参用β-actin，答曰“人人都这样用！”，果真一口老血喷出….

是以熊叔今天就来讲讲内参为什么进攻，进攻在哪？以及如何遴选内参。

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一、先弄显著为什么要设内参

生物体内存在一类基因，它们在多样组织、发育阶段、细胞周期景象或外部信号，都能褂讪抒发，关于保管生物功能是必须的，这类基因被称为“管家基因”（Housekeeping gene）。而管家基因由于这样能褂讪抒发的特质，被用作Western Blot和qPCR的内参。但实质上，由于实际条目以及组织类型等多样万般的轨则，莫得一种内参卵白适用于通盘样本。这个期间就需要咱们凭据实际条目及方针卵白的分子量大小遴选内参，有期间在通盘课题瞎想经由中检测不同的卵白可能需要更换不同的内参。

不设内参行么，诚然不行。不管是Western blot也曾qPCR，内参的建筑滥觞简略反馈出实际经由是不是正常，包括电泳、转膜、发光这些舛错有莫得问题。这个期间，内参的作用是充任空缺对照。

其次咱们再谈定量的问题：咱们跑Western blot除了想知说念目标卵白在细胞/组织中是否抒发，更进攻的是想知说念抒发量的上下。Western blot条带的灰度值简略帮咱们判断目标卵白的抒发品貌，但前提是你领先的上样量是一样的，这个上样量指的可不是上样体积，而是你的卵白浓度。是以咱们需要内参来帮咱们退换上样量，也便是用内参的信号来对方针卵白的信号进行规范化。举个例子：

用药物措置细胞A和细胞B，要是收细胞期间细胞量基本调换，那么临了样品的卵白浓度表面上大差不差，临了发光时在内参王人的基础上，咱们再去判断目标卵白的抒发量各异：

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EphA1 activation promotes the homing of endothelial progenitor cells to hepatocellular carcinoma for tumor neovascularization through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2016;35:65.

二、常用的内参有哪些

这部分我就简便来综合一下，想要单独详实了解某一卵白的同学提倡去GeneCards上仔细阅读：

1、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：是参与糖酵解的一种舛错酶，险些在通盘组织中都高水平抒发，在同种细胞或者组织中的卵白质抒发量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点的影响而保捏恒定。

2、beta-actin（β-肌动卵白）：actin是肌动卵白，细胞的一种进攻骨架卵白。actin大致可分为6种，其中4种是具有肌肉组织特异性：alpaha1 (ACTC1，心肌，ACTA1，骨骼肌) ，alpaha 2 ( ACTA2， 主动脉平滑肌)， gamma 2 ( ACTG2， 肠说念平滑肌)。其余2种beta和gamma 1是两种非肌型肌动卵白，闲居鉴别于多样组织中。beta-actin行为内参是获取了公认的，关于大多量组织和细胞来说，它闲居鉴别于细胞浆内，是已知最保守的卵白质之一。

3、Tubulin（微管卵白）：tubulin和actin雷同，是细胞骨架的构成部分，分为有两种类型：α-tubulin和β-tubulin。

以上三种内参不错得志80%以上的WB实际需求

三、如何遴选合适的内参

底下来讲讲遴选内参的几个原则：幼幼嫩穴

1、细目样本类型和靶基因亚细胞定位：

滥觞要洽商样原本源，是植物也曾动物，是东说念主也曾其他物种。例如来说，肌动卵白是高度保守的，着手于多样如东说念主、小鼠和鸡的bet actin同源性瑕瑜常高的。关联词像骨骼肌样本就不适用β-actin来作内参；相同兴趣，像文首提到的课题，缺氧和糖尿病这类的实际就不成拿GAPDH来行为内参，因为在这些细胞中GAPDH会存在高抒发。

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Hypoxia up-regulates SERPINB3 through HIF-2α in human liver cancer cells. Oncotarget. 2015;6(4):2206-2221.

其次咱们要明确待检测基因的亚细胞定位，跑细胞总卵白的Western blot一般用β-actin和Tubulin等细胞内较褂讪抒发的卵白行为内参没什么极度，关联词核卵白的内参要洽商用Lamin A，Lamin B，histone H3等；膜卵白的内参一般用N-Cadherin。

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EphA1 activation promotes the homing of endothelial progenitor cells to hepatocellular carcinoma for tumor neovascularization through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2016;35:65.

2、细目靶卵白和内参的分子量

一般咱们遴选内参与要检测的卵白分子量最佳收支5kDa以上，是以咱们要凭据检测的卵白的分子量来遴选合适的内参。比如咱们要检测的目标卵白分子量轻便为40kDa，这个期间最佳就不要选β-actin和GAPDH行为内参，不错洽商用Tubulin行为内参。

3、明如实际条目和内参品貌

这个是什么兴趣呢，其实很好解析：你在赐与某种措置的期间，你要洽商会不会影响内参的抒发水平；其次你要洽商你遴选的内参在你的样品中品貌是否过低，咱们要遴选褂讪且高抒发的卵白行为内参。

这里咱们来汇总几个例子：

a. 检测磷酸化等修饰型卵白时，要遴选结构卵白行为内参，如β-Actin 和β-Tubulin；

b. 细胞核的内参卵白PCNA，在 DNA S 期抒发，因此关于非增殖细胞不保举使用

c. 检测多组织多细胞样本对比抒发量时，最佳选用 GAPDH行为内参，因为GAPDH是代谢类卵白，在活组织中抒发比拟恒定，而β-Actin和β-Tubulin是结构卵白，不同组织的细胞结构会有各异性；

d. 用缺氧、指令糖尿病等措置时，由于GAPDH的抒发增高，不成用来作念内参；

e.作念细胞增殖相关的实际时，c-Jun由于对细胞增殖、细胞存活与细胞凋一火等进攻生理经由具有调控作用，本人抒发会发生变化，不合适用来作念内参；凋一火实际时，TBP、Lamin等也不适配合为内参

f.作念多样分泌液样本的期间，如血浆、乳汁、组织液等，由于莫得齐备的细胞结构，只可遴选一些分泌卵白行为内参比如Transferrin。

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Proteomic profiling for plasma biomarkers of tuberculosis progression. Mol Med Rep. 2018;18(2):1551-1559

4、踩在巨东说念主的肩膀上

要是你真的真的拿不定主意，最简便的要领便是看相关鸿沟的paper，看东说念主家用什么内参，想考为什么用这个内参（p.s. CNS为首选），趁便学学东说念主家的解题想路。

在这里回想一个表格供人人参考：

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四、跑内参时需要在意些什么

临了咱们来聊聊若何把内参跑的顺眼：

（1）滥觞很进攻的少量便是配胶，胶孔配的歪七扭八，内参不可能跑的顺眼：

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（2）由于内参卵白在样本中抒发量通常很高，是以上样量过多时，很可能导致临了发出来的条带一大坨，无法起到内参的规范化作用：

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有期间咱们必须普及上样量才调把目标卵白条带发的顺眼，那这种情况下莫得宗旨减少上样量如何办，咱们需要减轻内参的信号强度，一般最普通最简便的便是惟有在二抗孵育时加入HRP标志内参抗体。当发生上述情况时，你不错把二抗去掉，径直孵育偶联HRP抗内参抗体，大大减轻了抗体间的级联信号放大作用：

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(3)当目标卵白的分子量大小与选用的内参卵白分子量收支不大时，不错先进行目标卵白的抗体温育显色和检测。然后使用Stripping缓冲液洗掉膜上的抗体，再行进行内参卵白的抗体温育、显色检测：

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临了再给人人迥殊补充一个qPCR内参的数据库：

http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page

ICG数据库中荟萃了文件报说念的各物种、组织细胞适用的内参基因。

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